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     當(dāng)ELISA試劑盒競(jìng)爭(zhēng)法開(kāi)發(fā)以親和力大小比較為目的，往往會(huì)以IC50值評(píng)價(jià)待測(cè)樣品阻斷配體受體結(jié)合效果，IC50越小，待測(cè)樣品的阻斷效果越好。親和力競(jìng)爭(zhēng)法開(kāi)發(fā)的劑量曲線應(yīng)該有明顯的上下平臺(tái)期以得到較為穩(wěn)定的IC50值。生物學(xué)活性的方法學(xué)驗(yàn)證可參照USP1032, 1033,1034來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)方案的設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析。
   具體到elisa競(jìng)爭(zhēng)法的方法學(xué)評(píng)價(jià)，即制備相對(duì)于對(duì)照品理論效價(jià)為156%，125%，，80%，64%的樣品進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)比較對(duì)照品和樣品的IC50，得到樣品相對(duì)于實(shí)測(cè)效價(jià)，通過(guò)實(shí)測(cè)效價(jià)和理論效價(jià)的差異初步確認(rèn)以親和力大小比較為目的的elisa競(jìng)爭(zhēng)法的質(zhì)量。承接上文的全曲線選擇合適的8個(gè)濃度點(diǎn)，進(jìn)行初步的方法學(xué)驗(yàn)證的結(jié)果如下圖所示：該單次實(shí)驗(yàn)如果進(jìn)行多人和關(guān)鍵試劑的多批次實(shí)驗(yàn)，得到的實(shí)測(cè)效價(jià)經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析將構(gòu)成方法學(xué)驗(yàn)證中主要的幾個(gè)概念，精密度，準(zhǔn)確度，線性和范圍。如結(jié)果顯示單次實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)測(cè)效價(jià)和理論效價(jià)的差異在5%以?xún)?nèi)，能夠初步判斷該以親和力大小比較為目的elisa競(jìng)爭(zhēng)法有較好的方法質(zhì)量。
   當(dāng)elisa競(jìng)爭(zhēng)法開(kāi)發(fā)以定量為目的，選取7個(gè)點(diǎn)以理論濃度為X軸，信號(hào)值為Y軸進(jìn)行四參數(shù)函數(shù)擬合得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，將對(duì)照品的信號(hào)值重新代入標(biāo)準(zhǔn)曲線可得回測(cè)濃度值，多次實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析后回測(cè)濃度值和理論值的偏差決定了該條標(biāo)準(zhǔn)曲線的檢測(cè)上限，檢測(cè)下限，測(cè)量范圍，更加詳盡的方法學(xué)驗(yàn)證可參照2015版中國(guó)藥典第三部9012 生物樣品定量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則或者美國(guó)FDA版本的Guidance for Industry Bioanalytical Method Validation相關(guān)論述。
   對(duì)照品在12.5ng/ml-10000ng/ml較大的濃度范圍內(nèi)，回測(cè)濃度值和理論濃度的偏差在20%以?xún)?nèi)，初步能夠判斷該方法具備較好的質(zhì)量。需要說(shuō)明的此定量方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線僅僅是將親和力大小比較的劑量曲線刪除了上平臺(tái)期的低濃度點(diǎn)。筆者大量的實(shí)踐表明定量方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線明確的平臺(tái)期點(diǎn)會(huì)嚴(yán)重干擾標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量準(zhǔn)確性。

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